如何確定發(fā)光測量的微孔板間的交叉污染？

北京亙辰科技有限公司  Frank Han

    過(guò)去十幾年，發(fā)光實(shí)驗因具有*的特異性及靈敏度，且簡(jiǎn)單易用，多應用于藥物開(kāi)發(fā)研究?，F代光學(xué)測量?jì)x器，即便發(fā)光底物的光子發(fā)射水平極低依然能夠準確進(jìn)行計數。引起研究者們對SBS / ANSI標準微孔板設計中固有的光學(xué)干擾以及信噪比的極大關(guān)注。這篇短文比較了三個(gè)不同品牌制造商的微孔板中觀(guān)察到的光學(xué)干擾，發(fā)現使用黑色基底孔板可顯著(zhù)提高檢測的靈敏度。

分光光度法

    該研究比較了兩個(gè)不同品牌制造商的固體白色聚苯乙烯矮板與獲得的Porvair Sciences設計的白色單孔與實(shí)心黑色基底板的組合（圖1）。用螢火蟲(chóng)熒光素酶的發(fā)光測定做對比。有三種基于微孔板檢測獲得光學(xué)數據的方法。zui簡(jiǎn)單的方法是吸光度測量。根據Beer-Lambert定律，測量透射或吸收的單色光，可簡(jiǎn)單測出每孔中的相對濃度。酶標儀使用原理。

圖 1. Porvair *的白孔黑底96孔熒光檢測板

    熒光檢測靈敏度更高。在熒光計中，簡(jiǎn)單的截止濾波器可以從檢測光中去除反射的激發(fā)波長(cháng)，僅留下發(fā)射波長(cháng)。靈敏度卻是吸光度測量法的10倍以上。通過(guò)使用單色儀降低激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)的帶寬來(lái)實(shí)現更高的靈敏度。這種熒光計可以增加一個(gè)數量級的靈敏度。

生物發(fā)光是某些動(dòng)物和植物物種展示的自然發(fā)光現象，有水母發(fā)光蛋白和螢光素兩種常見(jiàn)發(fā)光機制。通過(guò)用熒光素酶基因構建轉染細胞，熒光素酶可以用作報告基因以評估細胞內的轉錄活性或為高通量篩選提供測定細胞凋亡的ATP濃度，檢測非常靈敏。這種發(fā)光測定法由幾家生命科學(xué)公司以AequoScreen ^TM，LucLite ^TM，ATPLite ^TM，OneGlo ^TM命名。發(fā)光計或多標記讀取儀是能夠讀取吸光度，熒光或發(fā)光模式的多用途光譜儀。圖2為三種光學(xué)檢測方法。

圖2:光度法檢測

微板設計考慮

    用于檢測開(kāi)發(fā)和高通量篩選的微孔板通常由聚苯乙烯聚合物制造。

    當在篩選中使用熒光素酶在孔板上觀(guān)察高動(dòng)態(tài)范圍出現困難時(shí)，相鄰的孔若顯示過(guò)強或過(guò)弱的信號，會(huì )導致孔之間的光學(xué)干擾，而得出錯誤的結果。一定量的可見(jiàn)光通過(guò)板的白色塑料孔壁“泄漏”，低信號也會(huì )在相鄰孔板中被錯誤附加而被檢測到。當讀取與低濃度信號相鄰的更亮的孔時(shí)，誤差zui大。使用分離的“煙囪”設計可以減少這種誤差，但卻不能消除誤差。圖3顯示Porvair白色固體96孔“煙囪”板（左圖）。每個(gè)孔具有與板矩陣分離的單獨形成的孔壁。

為了克服白色塑料孔壁的光“泄漏”問(wèn)題，Porvair Sciences開(kāi)發(fā)*的96孔黑底白孔板并獲得了。（圖3右圖）。的“雙射”工藝技術(shù)使得黑色聚苯乙烯板基底與白色孔板結合。這種“雙射”模具也用于制造具有透明底板的白色或黑色孔壁的熒光檢測板，Porvair Sciences Krystal 2000^TM零干擾板便是底部讀取吸光度和熒光檢測的耗材。其配方中含有高達18％TiO₂的亮白色孔板結合1％炭黑基底上，該板的光學(xué)干擾全部被消除。

數據表明：Porvair的黑底白孔板與其他兩個(gè)制造商的固體白板相比較，黑白板的孔間干擾分別降低82％和56％。

研究方法

在BMG Labtech的POLARStar Omega光譜儀使用5ul含有熒光素和螢火蟲(chóng)熒光素酶的溶液移液到每個(gè)96孔板的C4孔中（在下面的數據中顯示為“P”）并在510nm處讀數。加入5uL等分的過(guò)氧化氫反應。從每個(gè)樣品孔周?chē)目盏目字凶x取四個(gè)數值，每個(gè)讀數持續1秒，取平均值。熒光素酶信號在8-10分鐘內快速衰減，信號下降到幾乎為初始水平的50％時(shí)讀數。

每個(gè)實(shí)驗準備一個(gè)板，注意從未開(kāi)封的包裝中選擇干凈板。其他品牌的孔板重復該流程。使用相同類(lèi)型的空白板做背景讀數以進(jìn)行信噪比計算。

圖3. 樣品位置和樣品周?chē)母鱾€(gè)測量位置

結果

Porvair 96孔黑白板的計算信噪比為192000：1，而實(shí)心白板的信噪比為178000：1，背景顯示有用的可測量信號增加7.5％。

結論

   結果清楚地表明，Porvair科學(xué)的復合黑底白孔板提供了用于篩選和藥物開(kāi)發(fā)中低水平熒光素酶的測定。通過(guò)炭黑的有效淬滅和二氧化鈦增加反射率的組合產(chǎn)生*的信噪比和*的動(dòng)態(tài)范圍，使篩選者有機會(huì )在較低的檢測水平或減少試劑濃度的情況下篩選微弱的信號。

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關(guān)于Porvaier-Sciences

    Porvair-Sciences，微孔板產(chǎn)品的制造專(zhuān)家，服務(wù)生命科學(xué)，生物技術(shù)，醫藥研發(fā)和分子生物學(xué)的微孔板解決方案的所有應用，也為各*生物公司設計zui通用的過(guò)濾板，包括Waters，Millipore，Qiagen，Whatman，GE Healthcare，Varian，Biotage、當然還有Porvair。